[Thèse] Irene De Guidi, Soutenance jeudi 9 décembre 2021

Évaluation des bases génétiques de la variation de la production de H2S pendant la fermentation alcoolique chez Saccharomyces cerevisiae

Résumé des travaux.

Le profil sensoriel des boissons fermentées est l'une de leurs propriétés les plus importantes. Il repose sur un mélange unique et complexe de molécules volatiles qui interagissent avec notre système olfactif. Ces composés aromatiques peuvent apporter une note positive, ou au contraire extrêmement préjudiciable au profil global. Le sulfure d'hydrogène (H₂S), le principal composé soufré volatil produit par Saccharomyces cerevisiae au cours de la fermentation alcoolique, est l'un des composés les plus négatifs en raison de son impact élevé et de son faible seuil de perception. Dans des situations spécifiques comme lors de carence en nutriments azotés, il peut être surproduit, et dégrade alors la qualité aromatique du produit. Afin d'étudier ce phénomène, nous avons d'abord développé une nouvelle méthode sensible pour l'évaluation de la production totale de H₂S pendant la fermentation alcoolique reposant sur le piégeage du gaz à l’aide d’un métal et un dosage fluorimétrique. Cette méthode nous a permis d'évaluer les effets combinés de l'azote assimilable, du dioxyde de soufre et de la souche sur la production de H₂S par la levure durant la fermentation alcoolique du vin en utilisant un plan expérimental factoriel complet. Tous les facteurs se sont avérés significatifs, mais les souches de levure ont montré l'impact le plus important, suivi par l'azote et la teneur en sulfites. Nous avons ensuite appliqué cette méthode pour évaluer la variabilité de la production de H₂S de souches isolées dans différents environnements écologiques (fermentation du vin, vélum et écorce de chêne). De manière surprenante, les souches de vin ont montré une production significativement plus élevée que les souches de voile et de chêne, qui est accrue en présence de SO₂. La variation de la résistance de ces souches au cuivre a montré un profil similaire à celui de la production de H₂S, et le nombre de copies du gène CUP1 présent dans le génome de ces souches était corrélé à la production totale de H₂S. Ceci nous permet de proposer que l'amplification du gène CUP1 de certaines souches pourrait participer à une production excessive de H₂S causée par la stimulation de l'activité de la voie assimilation du soufre pour la biosynthèse de la cystéine nécessaire à la synthèse de la protéine Cup1. Dans un troisième temps, nous avons essayé de déchiffrer les bases génétiques des différences entre les souches dans leur capacité à produire du H₂S en présence de SO₂, en utilisant un croisement entre une souche de vin et une souche de voile ayant deux capacités différentes à produire du H₂S. Nous avons appliqué une analyse de ségrégants en mélange (BSA) à une descendance de 96 souches issues du croisement. La comparaison des fréquences alléliques le long du génome des pools de ségrégants produisant une faible ou une forte quantité de H₂S total pendant la fermentation alcoolique a mis en évidence deux régions impliquées dans les variations de production de H₂S. Les variations dans quatre gènes activant différents mécanismes ont été trouvées pour expliquer ce trait. Ces données représentent un nouvel aperçu de la régulation de la production de H₂S pendant la fermentation du vin et montrent l'interaction entre la voie d'assimilation du soufre et le métabolisme cellulaire.

Contacts : Bruno Blondin (Montpellier SupAgro, UMR SPO) & Jean-Luc Legras (INRAE, UMR SPO)

Deciphering the genetic bases of variation of H₂S production during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae

Abstract: The sensory profile of fermented beverages is one of their most important properties. This sensory profile relies on a unique and complex blend of volatiles molecules that impact our olfactive system. While aroma compounds provide a positive note, some are extremely detrimental to the global profile. Hydrogen sulfide (H₂S), the main volatile sulfur compound produced by Saccharomyces cerevisiae during alcoholic fermentation, is one of the most negative compounds given its high impact and low sensory threshold. Under specific conditions such nitrogen nutrient limitation, it can be overproduced, which leads to poor aromatic quality. In order to investigate these phenomena, we first developed a new sensitive method for the evaluation of total H₂S production during alcoholic fermentation using a metal trap and a fluorescent probe. This method, enabled us to evaluate the combined impact of assimilable nitrogen, sulfur dioxide and strain on sulfide production by yeast during wine alcoholic fermentation using a full factorial experimental design. All factors were significant, but yeast strains showed the highest impact, followed by nitrogen and sulfite content. We then applied this method to evaluate the variability in H₂S production of strains isolated in different ecological environment (wine fermentation, flor velum and oak bark). Surprisingly, wine strains displayed a significantly higher production than flor and oak strain, that became even sharper in presence of SO₂. The analysis of copper resistance of these strains varied similarly to H₂S production. The analysis of the number of copies of the CUP1 gene present in the genome of these strains was significantly correlated to the total production of sulfide. This enables us to propose that the amplification of the CUP1 gene of some strains may participate in an excessive H₂S production caused by the stimulation of the activity of the SAP pathway for the biosynthesis of cysteine required for the synthesis of Cup1 protein. In a third phase, we tried to decipher the genetic bases of the differences between strains in their ability to produce H₂S in the presence of SO₂, using a cross between a wine and a flor strain. We applied a Bulk Segregant Analysis (BSA) to a 96 strain progeny derived from these two strains having two different abilities to produce H₂S. The comparison of the allelic frequencies along the genome of pools of segregants producing a small or a high quantity of total H₂S during alcoholic fermentation pointed out to two regions involved in the variations of H₂S production. The variations in four genes activating different mechanisms were found to explain this trait. This data represents a new insight into the regulation of H₂S production during wine fermentation and show the interplay of sulfur assimilation pathway and cell metabolism.