[Thèse] Carmen Becerra-Rodriguez, Soutenance de thèse vendredi 10 décembre 2021

Diversité des transporteurs d'oligopeptides chez les souches œnologiques de Saccharomyces cerevisiae

Résumé des travaux

En œnologie, l'azote est un nutriment essentiel pour les levures et sa quantité est un facteur important de la cinétique de fermentation. Les principales sources d'azote dans les moûts de raisin sont l'ammonium et les acides aminés libres ; cependant, les oligopeptides sont également des sources secondaires importantes dans l’apport en azote. Récemment, une nouvelle famille de transporteurs (Fungal Oligopeptide Transporters, Fot) a été identifiée dans les souches de vin de Saccharomyces cerevisiae, absente dans les souches issues d'autres niches écologiques. La présence de Fot1, Fot2 et Fot3 dans les souches de vin de S. cerevisiae est issue d’un transfert horizontal de gènes (HGT) de la levure Torulaspora microellipsoides, contenant les protéines Fot2Tm, FotX et FotY. Dans la souche de vin EC1118 de S. cerevisiae, les membres Fot1 et Fot2 sont responsables d'une plus large gamme d'utilisation des oligopeptides par rapport aux souches ne contenant pas de Fot. Cela conduit à une meilleure efficacité de fermentation et à une production accrue de composés organoleptiques souhaitables dans le vin.
L'objectif principal de cette thèse est la caractérisation des membres de la famille Fot afin d’étudier la diversité fonctionnelle de ces différentes protéines, compte tenu de leur haute homologie de séquence. Nous apportons la preuve que l'expression du gène FOT dépend de la souche, du stade de fermentation œnologique et de la composition de l'azote assimilable du milieu. De plus, nous avons démontré que Fot1 est localisé dans la membrane plasmique de la levure grâce à des études de co-localisation avec un marquage avec la Gfp. À l'aide de CRISPR/Cas9, nous avons construit des souches de vin de S. cerevisiae contenant chaque Fot différent comme seul transporteur d'oligopeptides pour analyser leurs préférences en oligopeptides par phénotypage en microplaque. Les résultats de la consommation d'oligopeptides ont montré que les homologues Fot ont des spécificités oligopeptidiques différentes, suggérant que la divergence de séquence ponctuelle entre les gènes FOT peut être cruciale pour la spécificité du substrat, la liaison et l'activité de transport. En combinant des modèles de structure de protéine Fot avec des expériences de docking moléculaire, nous avons prédit les résidus d'acides aminés au sein des protéines Fot potentiellement impliqués dans la liaison au substrat. De plus, nous avons évalué la distribution des séquences homologues de Fot parmi les espèces fongiques. Les séquences Fot putatives trouvées dans les levures ascomycètes et les champignons filamenteux ont montré une distribution inégale qui ne suivait pas la taxonomie générale, suggérant une trajectoire d'évolution complexe qui peut inclure plusieurs duplications de gènes et événements HGT. Globalement, ce travail contribue à une meilleure compréhension de la famille des protéines Fot, possédant un rôle clé dans l'utilisation des oligopeptides par S. cerevisiae en fermentation œnologique.
Dans un deuxième axe de ce travail, nous avons évalué l'impact d'une stratégie d'évolution adaptative en laboratoire (ALE), conçue pour augmenter l'utilisation d'oligopeptides comme source d'azote, dans les performances de fermentation des levures. Les populations dérivées de notre stratégie ALE ont révélé des taux de fermentation plus élevés et des temps de fermentation diminué par rapport à leurs ancêtres. Ces nouveaux phénotypes constituent une amélioration des capacités fermentaires, qui ouvre la porte à une caractérisation plus poussée de nos populations dérivées de notre expérimentation pour leur exploitation potentielle en tant que souches commerciales en vinification.

Contact : Virginie Galeote (INRAE, UMR SPO)

Diversity of the Fungal Oligopeptide Transporters in Saccharomyces cerevisiae wine strains

Abstract : In wine fermentation, nitrogen is an essential nutrient for yeasts and its relative abundance is an important modulator of fermentation kinetics. The main sources of nitrogen in grape musts are ammonium and free amino acids; however, secondary sources such as oligopeptides are also important contributors to the nitrogen supply. Recently, the novel family of Fungal Oligopeptide Transporters (Fot) has been identified in Saccharomyces cerevisiae wine strains, while being absent in strains from other ecological niches. Presence of Fot1, Fot2 and Fot3 in S. cerevisiae wine strains is due to horizontal gene transfer (HGT) from the yeast Torulaspora microellipsoides, which harbors Fot2Tm, FotX and FotY proteins. In the S. cerevisiae wine strain EC1118, members Fot1 and Fot2 are responsible for a broader range of oligopeptide utilization in comparison to strains not containing any Fot. This leads to better fermentation efficiency and an increased production of desirable organoleptic compounds in wine.
The main objective of this thesis is the characterization of Fot family members to understand their biological significance, considering their high sequence identity. We provide evidence that FOT gene expression is dependent on the strain, stage of enological fermentation and composition of the assimilable nitrogen. Moreover, we demonstrated that Fot1 is localized in the yeast plasma membrane through co-localization studies with Gfp labelling. Using CRISPR/Cas9, we constructed S. cerevisiae wine strains containing each different Fot as the sole oligopeptide transporter to analyze their oligopeptide preferences by phenotype microarrays. Results of oligopeptide consumption showed that Fot counterparts have different oligopeptide specificities, suggesting that punctual sequence divergence between FOT genes can be crucial for substrate recognition, binding and transport activity. Combining Fot protein structure models obtained by a threading strategy together with molecular docking experiments, we have predicted the amino acid residues in Fot potentially involved in substrate binding. Additionally, we inspected the distribution of Fot homologous sequences among fungal species. Putative Fot sequences found in ascomycetous yeasts and filamentous fungi showed a patchy distribution that did not follow the general taxonomy, suggesting a complex evolution trajectory that may include several gene duplications and HGT events. Overall, this work contributes to a better understanding of the Fot family, which have demonstrated a key role in the utilization of oligopeptides by S. cerevisiae in enological fermentation.
In a second focus of this work, we have evaluated the impact of an adaptive laboratory evolution (ALE) strategy designed to increase the utilization of oligopeptides as nitrogen source in yeast fermentative performance. Populations derived from our ALE strategy showed higher fermentation rates and shorter times to complete fermentation in comparison to their ancestors. These new phenotypes constitute an improvement in the fermentative capacities, which opens the gate to a further characterization of our ALE-derived populations for their potential exploitation as commercial strains in winemaking.